Музей складається з трьох залів, розділених по епохах: Зелений зал (дореволюційний період будівництва та становлення Курсько-Харківсько-Азовської дороги), Червоний зал (радянський період розвитку Південної залізниці) і Синій зал (історія розвитку за часів незалежної України). У музеї зібрано безліч старовинних і рідкісних експонатів, унікальні документи та фотографії, макети рухомого складу. Однією з визначних пам'яток музею є величезний макет маршруту швидкісного «Столичного експреса» Харків-Київ, який з точністю відтворює не тільки сам поїзд, але і залізничну ділянку Київ-Харків з копіями будівель вокзалів Києва, Харкова, Полтави-​​Київської та Миргорода. На макеті функціонує система автоматичної централізації зі світлофорами, стрілочними переводами та залізничним переїздом, а поїзд відправляється і робить зупинки під музику і оголошення дикторів.